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体视镜暗场照明原理图解--体视显微镜专题之四(Microimage译)-资料-中国显微图像网

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    体视镜暗场需要有独特的主机,它要包括一个反射镜,一个遮光板――用来挡住垂直射向样品的光线,形成斜照明。体视镜的暗场照明与传统复合显微镜的暗场照明相同,都需要具有一系列透镜的聚光镜或具有特殊中间镜的聚光镜,这种中间镜能够将光线以特殊的角度反射出去。

    暗场显微术适用于未经染色的样品,这些样品的折射率通常与环境相近,如水生生物,培养中的组织。这些样品的折射率约为1.2或1.4,与周围介质折射率1.3相比,可忽略不计。
    如图一为带有明场及暗场照明功能的体视显微镜Nikon SMZ1500,在这台体视镜的底座上有一个透明的玻璃板。体视镜接有数字网络照相机Nikon DN 100,通过它可以将收集到的图片信息传送的远处的观察者。

    下面将要重点讨论暗场照明的机制。

    在暗场照明中,光路的光轴处有一块遮光板,用来遮住直射光,是没有遮住的光线成一定角度斜射到样品上。在复合显微镜中,光线通过聚光镜在样品处形成一个倒圆锥形的中空光柱。如果载物台上没有样品,而聚光镜的数值孔径又大于物镜的话,那么光线斜射就会射出物镜前透镜,不会进入物镜。这时,视野是暗的。
 

  

    在前面提到的Nikon SMZ1500体视镜采用了一个特制的七边环形镜(Figure 2),他可以减少进入物镜的弥散光。这些环面镜的内侧为反光镜,功能类似于高数值孔径的暗场聚光镜。
    现在,主流的暗场聚光镜中,环面镜的上边缘向中心弯曲,形成心形聚光镜,这种聚光镜将减少进入物镜的弥散光。Figure3中所示,为心形环形镜与传统圆筒形环形镜的对比。如左边的聚光镜,将显著提高样品与背景间的对比。

    在暗视野下观察透明样品时,光束斜射到样品上,由于细胞膜,细胞核及细胞中的细胞器的光学性质不同,这些光线发生衍射,反射,和/或折射。这些散射光线会进入物镜,得到亮样品暗背景的效果。由于暗场照明下的图像完全由散射光组成,这样的图像有炫光,并且会有不同程度的变形,所以,暗场照明下的图片与样品的实际几何形状并不完全一致。
    Figure4中对比了纤维的明场及暗场成像效果。纤维样品用载玻片盛放,并盖有盖玻片采用Canada balsam(加拿大香胶)封片。Figure4(a)及4(b)分别为尼龙纤维明场及暗场下的对比图。如图,明场下,尼龙纤维的对比很弱,在白色背景下,无法分辩样品细节。与之相比,在暗场下(Nikon SMZ1500 带有环形镜)纤维内部的细节展示非常清楚,而且图片中的景深更易辨别。而Figure4(c)与4(d)为一种对比度过强的样品(菠萝纤维)分别在明场下与暗场下成像的对比图。在明场下的纤维几乎完全不透明。而在暗场下,则可看到更多的细节,如,在明场下并不清晰的纵向分裂。

    由于暗场下,射向样品的光线发生了反射,折射,及衍射,而发生极小角度的偏移,所以在这种情况下得到的图像虽然分辨率与明场下相同,但是图片的特性与明场下并不完全相同。
    在暗场下明亮样品光线重叠在一起与暗背景形成了强烈的反差。被遮光板遮挡后的光线斜射到样品上,形成各种光线相互作用,生成样品像。
    由于暗场显微术中直射光被遮住,浪费了很多照明光,因此,需要高密度光源。体视镜的暗场照明机身考虑到了这一点,采用高密度的钨卤灯提供暗场照明。

   

    现在很多产品都能够实现体视镜透射暗场的改造。典型的暗场照明器如Figure5,Figure6所示。Figure5中采用环状纤维照明光源,载物台带有反光镜及遮光板。环状照明器产生的光线经过反射镜反射及遮光板遮挡形成空心圆锥光。样品可直接放在载物台上进行观察。环状光源由外接电源供电,采用高密度钨卤灯。另一种能同时提供明场照明的照明器如Figure6所示。这种照明器通过滑块实现明场及暗场照明之间的转换。同时,照明器中还带有纤维光源。
    适合暗场观察的样品有很多种,制样时要格外小心。因为诸如指纹,灰尘,纤维,清洁剂痕迹都会产生像,影响图像观察。样品的厚度及盖玻片的厚度也很重要,总的来说,薄的样品更好,它可以降低假象的干扰。

    在合宜的条件下,暗场成像的效果会非常惊人(比如,可以尝试新鲜血液)。通常,在名场下,对比度均匀的样品都适合暗场观察,观察时可以分辨出轮廓,边界以及折射率的变化。很遗憾的是,暗场观察无法应用于样品内部结构的观察。其他样品在暗场下也可得到很好的效果,包括已经染色的样品。比如植物薄切片(染色或未染色均可),化石,骨骼切片,胚胎,毛发(人及动物均可)。
    在二十世纪上半页,复合式及体视暗场显微术在聚光镜及照明器上得到了极大的发展。但这些改进随着相差,DIC霍夫曼等反差更高的技术的出现变得缓慢。最近,新体视显微术,如Nikon斜射相干对比显著提高了透明样品的对比度。由于暗场与荧光观察的结合的好处,现在对暗场的兴趣又增多了。
    暗场显微术是生物及医药研究中极佳的观察方法。这一技术可揭示其他方法看不到的生物,工业样品的细节结构。

来自显微镜 http://www.microimage.com.cn

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英文原文出处:http://www.microscopyu.com/articles/stereomicroscopy/stereodarkfield.html

 

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